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L'expérience 2.3. La détection de la lévulosurie par le test de Seliwanoff.

L'expérience 1. La détermination quantitative de l'activité de l'amylase dans le sérum du sang.

L'urine et le sérum du sang des gens sains ont l'activité de l'amylase basse en comparaison de l'amylase salivaire. Normalement dans le sang l'activité de l'amylase pancréatique fait 0-50 U/l, dans l'urine – 1-17 U/l. La détermination de l'activité de l'amylase dans l'urine et dans le sérum du sang est utilisée à la pratique clinique au diagnostic des maladies du pancréas. À la pancréatite aiguë l'activité de l'enzyme dans le sang et dans l'urine augmente à 10-30 fois, à la pancréatite chronique, au cancer du pancréas, à la crise de la lithiase biliaire – à 3-5 fois. Aux troubles de la fonction rénale, ainsi qu'à certaines maladies sanguines l'activité augmentée de l'enzyme dans le sang n'est pas conjuguée avec l'augmentation de son activité dans l'urine.

L'enzyme l'amylase catalise l'hydrolyse de la liaison α-1,4-osidique de l'amidon et du glycogène. La méthode est basée sur le dosage colorimétrique de la concentration de l'amidon avant et après l'hydrolyse enzymatique de la coloration à la réaction avec le réactif de Lugol.

Dans 2 tubes on verse selon 1 ml de la solution de l'amidon. Dans un tube de contrôle on ajoute 0,02 ml du sérum sanguin. On met au bain-marie (37°) pour 5 minutes.

Dans chaque tube on ajoute selon 1 ml de la solution de Lugol et 8 ml de l'eau distillée, et dans tube de contrôle – encore 0,02 ml du sérum sanguin, on mélange.

On mesure la densité optique des deux solutions à l'aide de photoélectrocolorimètre à 630 nm dans la cuvette avec l'épaisseur de la couche de 10 mm par rapport à l'eau.

On calcule l'activité de l'amylase en utilisant la formule :

((Dc – Dp)/Dc)×200,

où Dc – la densité optique de l'essai de contrôle, Dp – de l'essai pilote.

L'expérience 2. Le diagnostic rapide des pathologies du métabolisme glucidique.

On fait toutes les expériences avec les échantillons de l'urine 1 et 2.

L'expérience 2.1. La réaction de Trommer avec l'hydroxyde cuivrique.

Vers 1 ml de l'urine on verse le volume égal de 10 % solution de l'hydroxyde du sodium et selon les gouttes de 1 % solution du sulfate du cuivre jusqu'à l'apparition du dépôt fixe de l'hydroxyde du cuivre (II)

L'expérience 2.2. Le test de Haines.

Vers 3-4 ml du réactif de Haines ( le sulfate du cuivre, l'hydroxyde du sodium et la glycérine) on verse 1 ml de l'urine et on chauffe la partie supérieure du mélange réactionnaire jusqu'au bouillonnement.



L'expérience 2.3. La détection de la lévulosurie par le test de Seliwanoff.

La méthode est basée sur la transformation de la fructose à l'hydroxyméthylefurfural, qui est condensé avec la résorcine (0,05 % solution à 20 % acide chlorhydrique), en formant la liaison de la couleur rouge, ça passe à la chauffe et en présence de l'acide chlorhydrique. Dans un tube on verse 1 ml du réactif de Seliwanoff (la solution de la résorcine dans l'acide chlorhydrique) et on ajoute 2 ml de l'urine. On chauffe un tube au bain-marie jusqu'au bouillonnement. On apprécie au moment du bouillonnement; à la chauffe de longue durée c'est le glucose qui peut donner la réaction positive.

L'expérience 2.4. La méthode enzymatique de la détermination qualitative et semi-quantitative du glucose dans l'urine à l'aide de la bandelette de test "GLUCOPHAN".

Les bandelettes de test "GLUCOPHAN" ont la ligne transversale de la couleur jaune clair imprégnée par les solutions des enzymes de glucose oxydase, de peroxydase et par le colorant (dérivé de la benzidine). La glucose oxydase – la flavoprotéine, dont le groupe prosthétique est FAD. Elle catalise le transfert de deux atomes de l'hydrogène du glucose à l'oxygène de l'air. Le peroxyde de l'hydrogène se désagrège par l'enzyme de la peroxydase, à cause de quoi se passe l'oxydation du colorant. Le changement de la coloration du colorant à son oxydation atteste la présence du glucose dans l'urine.

Dans le verre on verse la petite quantité d'urine étudiée. On immerge la bandelette "GLUCOPHAN" à l'urine examinée de manière que l'indicateur soit mouillé entièrement. On retire immédiatement la bandelette et on attend 1 minute. On compare la coloration de la ligne avec l'échelle colorée. On trouve la plus grande coïncidence de la couleur de la bandelette "GLUCOPHAN" avec la couleur sur l'échelle colorée et on détermine approximativement la concentration du glucose.

L’expérience 3. La détérmination quantitative de l’acide pyruvique dans l’urine L’acide pyruvique (AP) est un des produits intermédiaires du métabolisme des glucides. En cas des conditions anaérobies (l’hypoxie) il se réduit en acide lactique; en cas des conditions aérobies il subit la décarboxylation oxydative et se transforme en acétyl-CoA. L’acide pyruvique – une des sources essentielles de néoglycogenèse. Il est le lien entre le métabolisme des glucides, des lipides et des protéines. A la suite de grande vitesse de transformation la quantité de l’acide pyruvique aux liquides biologiques n’est pas grande.

Normalement le sang contient 0,5-1 mg/100ml de l’AP (0,03-0,1 mmole/l), l’urine - 2 mg/100 ml. Par jour avec l'urine se dégagent 10-25 mg d'AP.

On observe l’augmentation de concentration du pyruvate dans le sang en cas de travail musculaire et l’insuffisance de la vitamine B1. En cas de grande charge phisique la quantité de pyruvate peut s’augmenter jusqu’aux 570 mcmole/l, son élimination avec urine est aussi augmentée. Outre cela, on observe cet événement en cas des maladies du parenchyme de foie, de diabète sucré, de décompensation cardiaque, de toxicose etc. Presque tous les facteurs, qui provoquent l’augmentation de concentration de l’acide dans les tissus (la tétanie, le tétanos, l’hypoxie de n’importe quelle genèse, les tumeurs malignes, l’hépatite aigue) amènent, en générale, à l’augmentation de sa quantité dans le sang et dans l’urine.

Le principe de la méthode: le pyruvate et 2,4 – dinitrophénylhydrazine forment la combiné colorée – 2,4 – dinitrophénylhydrazonepyruvate. La combinaison de mélange des réactifs s’extrait par le toluène. Au milieu alcalin, à la présence de solution alcoolique de l’alcalin on observe la coloration rouge-orange, dont l’intensité est directement proportionnelle à la quantité de l’acide pyruvique.

 

 

On prend 3 tubes. Dans un tube on verse 1 ml de l’urine, diluée 3 fois (l'essai à examiner), dans 2 tube – 1 ml de solution de standard de l’AP (l'essai standart), dans 3 – 1 ml de l’eau (l'essai de côntrole). On ajoute 0,5 ml de 0,1% 2,4 – dinitrophénylhydrazine, on mélange et dans 5 min on ajoute 2,5 ml de toluène saturé par l’eau. Après l’agitation, on laisse reposer la solution pendant 1 min, pour que l’eau et le toluène se délitent.

On prend 1 ml de la couche supérieure de toluène avec la pipette seche et on le transmet dans un tube sec. On ajoute 3 ml de la solution alcoolique de KOH.

Dans 10 min on fait le photométrage contre le côntrole à l’aide de PEC. La longueur d’onde 400-415 nm.

On calcule suivant la formule: Õ=(De*50mg/Ds)*3, où

Õ - la concentration de l’AP dans l’urine;

De – la densité optique de la solution à examiner;

Ds - la densité optique de la solution de standard;

50 - la concentration de l’acide pyruvique au standard, mg %;

3 – degré de la dilution de l'urine.


Date: 2016-01-14; view: 577


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